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白蛋白与白蛋白融合蛋白的亲和层析纯化

人血清白蛋白

人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是血浆中含量最丰富的蛋白质,占血浆蛋白的40-60%,半衰期长达20,具有重要的生理学和药理学功能,能维持血液正常的渗透压,稳定电解质和酸碱平衡,参与物质运输。临床上,人血清白蛋白一直被誉为“黄金救命药”,主要用于手术输血和危重病人的补液、治疗创伤或烧伤引起的休克、治疗低白蛋白血症等。

人血白蛋白(图片来源于网络)

人血清白蛋白在临床上使用量很大,通常每剂量高达10g。而市售的治疗性人血白蛋白多数来源于血浆,经冷乙醇沉淀、柱层析、过滤等多种技术结合的方式纯化获得。由于人血浆来源有限、动物源性污染风险高,近年来,全球范围内很多电子娱乐网站和实验室都在尝试采用基因工程的手段来制备重组人血清白蛋白(Recombinant Human Serum Albumin,rHSA),2024年4月8日,通化安睿特生物制药股份有限电子娱乐网站自主研发的重组人白蛋白注射液,完成在俄罗斯的注册,成功获得欧亚经济联盟-俄罗斯联邦卫生部批准上市,成为全球首个获批上市的治疗性重组人血清白蛋白产品,极大推动了全球生物医药产业的发展。

人血清白蛋白由585个氨基酸残基构成,无糖基化,分子量约66kDa,亲水性较高,分子中包含3个结构域(Domains)和35个半胱氨酸残基,组成17对分子内二硫键和一个游离的半胱氨酸残基,确保了其结构域的刚性特点。

Mimetic Blue® SA HL P6XL层析填料

Mimetic Blue® SA HL P6XLAstrea Bioseparations电子娱乐网站推出的白蛋白亲和层析填料,填料基架是粒径均一的交联琼脂糖,配基是合成的蒽醌化合物,可以特异性结合白蛋白,用于血浆来源的白蛋白重组白蛋白的捕获。Mimetic Blue® SA HL P6XL的性能参数如下表所示。

Mimetic Blue® SA HL P6XL亲和层析填料具有良好的化学稳定性,如图1所示,将填料浸泡于不同pH的试剂中,测试3个月,在pH 3-13的范围内,填料无明显配基脱落,结合效果良好,除此之外,Mimetic Blue® SA HL P6XL亲和层析填料常见的变性剂如尿素和盐酸胍、表面活性剂、还原剂等兼容良好。基于其良好的化学稳定性,Mimetic Blue® SA HL P6XL亲和层析填料可高效重复使用,在超过100个批次(>100 cycles)重复使用后,仍保持卓越的结合载量和纯化效果。

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1. Mimetic Blue® SA HL P6XL的pH耐受性测试

在一项测试中,研究人员将未经处理的人源性血清直接上样到装有Mimetic Blue® SA HL P6XL填料的层析柱中,层析工艺参数如下表所示:

由图2的层析图谱和图3的SDS-PAGE检测结果可以看出,Mimetic Blue® SA HL P6XL可以选择性的结合血清中的白蛋白,其他蛋白随流穿液离开层析柱,洗脱液中白蛋白纯度高达96%,回收率高于90%。

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图2. Mimetic Blue® SA HL P6XL捕获血浆来源白蛋白的层析图谱

 

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图3. SDS-PAGE检测结果Lane 1: molecular weight marker; Lane 2: load; Lane 3: flow through; Lane 4: elution

Mimetic Blue® SA HL P6XL订购信息

散装填料

预装柱



白蛋白融合蛋白


白蛋白融合蛋白示意图(图片来源网络)


白蛋白融合蛋白(rHSA Fusion Proteins)是将目的蛋白与白蛋白进行融合表达的蛋白质,可延长目的蛋白在体内的半衰期,在生物医药领域具有广泛的应用价值。早在1992年,欧洲科学家就尝试将白蛋白和CD4蛋白基因融合后在酵母体系中表达,用于HIV的治疗。2014年,GSK电子娱乐网站推出一种GLP-1受体激动剂阿必鲁肽Albiglutide),用于治疗2型糖尿。靡┪锸墙礁鯣LP-1串联后与rHSA融合,具有长效性,仅需每1-2周注射一次,可有效帮助患者管理其血糖水平。2016年,CSL Bering电子娱乐网站IdelvionFDA批准上市,该产品是凝血因子IX和rHSA的融合蛋白,在血液中半衰期更长,用于治疗B型血友病。此外,还有很多其他类型的白蛋白融合蛋白正处于临床试验阶段,例如,生长因子-rHSA融合蛋白、白介素2-rHSA融合蛋白、抗体片段-rHSA融合蛋白(如scFv-rHSA融合蛋白)、干扰素α-2b-rHSA融合蛋白等。

AlbuPure®层析填料

AlbuPure®是Astrea Bioseparations和Albumedix电子娱乐网站合作开发的白蛋白亲和层析填料,填料基架是粒径均一的高交联琼脂糖,配基是合成的三嗪化合物,具体高流速、高动态结合载量、强化学耐受性等特点,主要用于白蛋白融合蛋白的纯化。AlbuPure®的性能参数如下表所示。

AlbuPure®具有卓越的白蛋白融合蛋白结合性能,如图4所示,研究员在不同pH值不同流速的上样条件下,探究了AlbuPure®对scFv-rHSA的动态结合载量,结果表明,在pH=4.5,240cm/h线性流速下,AlbuPure®对目标融合蛋白的动态结合载量最佳,10%流穿时,载量高达38.4mg/mL。

图4. AlbuPure®动态结合载量研究

Mimetic Blue® SA HL P6XL类似,AlbuPure®亲和层析填料也具有优秀的化学稳定性,可耐受1M NaOH溶液的清洁,对常见的变性剂、表面活性剂、还原剂等兼容性良好。

一项研究测试中,研究员使用酵母体系表达Anti-HIV gp41-rHSA融合蛋白(72kDa),收获液经澄清后,上样到装有AlbuPure®的层析柱中,层析工艺参数如下表所示:

由图5的层析图谱和图6的SDS-PAGE检测结果可知,AlbuPure®可以高效捕获Anti-HIV gp41-rHSA融合蛋白,杂质蛋白在上样时流穿,经过三次不同pH值下的淋洗步骤,可进一步去除少量挂柱的杂质蛋白,目标融合蛋白最后由辛酸钠洗脱下柱,纯度极高。

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图5. AlbuPure®纯化Anti-HIV gp41-rHSA融合蛋白的层析图谱

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图6. SDS-PAGE检测结果

Lane: 1. Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1?g)

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散装填料

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Astrea Bioseparations1987年孵化自剑桥大学,拥有超过30年层析介质研发和生产经验,是世界级层析介质产品与服务供应商。目前使用Astrea的产品已有超过21个生产工艺通过了FDAEMA的批准。Astrea Bioseparations在全球拥有3个研发和生产基地,专注为生物大分子和CGT领域提供行业领先的层析介质和技术服务。Astrea Bioseparations推出的基于纳米纤维的新型层析技术,解决了传统生物分离工具载量低和工艺耗时问题,实现更快、更环保、更具成本效益的纯化过程,完全符合当今生物治疗创新的需求。

 

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参考文献

1. 血清白蛋白的生物学特性研究进展,生命科学,第25卷,第10期,2013年10月

2.人血清白蛋白纯化技术研究进展,生物工程学报,18卷6期,2002年11月

3. 人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造中的应用,生命科学,第27卷,第9期,2015年9月

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