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HCPure?多模式层析填料,助力生物制品的高效纯化

近年来,生物制药行业呈现出繁荣发展的趋势,很多大分子生物制品已经过监管部门批准上市,另有不少创新型大分子正处于临床后期或上市前申报阶段,即将为患者带来福音。例如,基于CHO细胞表达的单克隆抗体、基于大肠杆菌E.coli体系表达的重组蛋白或纳米抗体、基于HEK293细胞或昆虫细胞SF9表达的腺相关病毒(AAV)、基于酵母细胞表达的病毒样颗粒(VLP)等。不同于传统的小分子化学药,生物大分子的表达体系更为复杂,杂质种类更多宿主蛋白(HCP)和宿主DNA残留(HCD),杂质结构相对复杂,这给下游纯化带来了极大的挑战。

         基于传统微球技术的层析工艺是生物大分子纯化的重要手段,具有工艺性能稳定、放大性良好等优点。近年来,多模式层析填料受到越来越多的关注。多模式层析填料往往具备至少两种相互作用机制,其中最常见的是将离子交换模式与疏水相互作用模式结合,可以在广泛的pH和电导率范围内有效纯化目标分子。

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图1. HCPureTM配基结构和作用方式

       

HCPureTM英国Astrea Bioseparations电子娱乐网站2023年推出的多模式层析填料,填料基架为粒径均一的高交联琼脂糖,基架上修饰有化学合成的小分子配基(图1),主要以疏水相互作用的方式结合料液中的杂质,同时兼具氢键相互作用模式(与市售主流产品作用原理不同,形成互补),适用于多种表达体系,在广泛的上样条件下,能稳健的去除料液中的HCP(宿主细胞蛋白)、HCD(宿主细胞DNA)、聚集体、分子片段等工艺或产品相关杂质。表1展示了HCPureTM在常见的表达体系中杂质去除能力。

表1. HCPureTM在多种表达体系中的应用效果

 

1. HCPureTM大肠杆菌(E. coli 表达体系中可以有效去除HCP

在该应用案例中,研究人员使用大肠杆菌(E. coli )表达纳米抗体Vκ,收获液先经过Protein L亲和层析纯化,洗脱液中和后调节成不同的pH(6.0-8.0)和电导率(6-18mS/cm),随后以流穿模式上样HCPureTM,收集流穿液和淋洗液,检测Vκ和HCP的含量,以探究HCPureTM的最佳上样条件。测试条件如下表所示:

 

2. E.coli表达体系中HCPureTM上样pH和电导率的探究

 

图2的检测结果可知,在较低的pH(6.0)和较低的电导率(6ms/cm)上样条件下,HCP的去除效果最佳,同时目标分子Vκ的回收率最高。在最优上样条件下,料液中的HCP可以从30000ppm降至200ppm(2个log值的去除能力),Vκ回收率大于85%(表2)。

2. HCPureTME. coli 表达体系中可以有效去除HCP

 

2. HCPureTM在CHO细胞表达体系中可以有效去除HCP

在该应用案例中,研究人员使用CHO细胞表达IgG型单克隆抗体,澄清后的收获液先经过Protein A亲和层析纯化,洗脱液经中和后调节成不同的pH(4.0-9.0)和电导率(8-18ms/cm),再以流穿模式上样到HCPureTM中,收集流穿液和淋洗液,检测IgG和HCP含量,其中,pH 6.0、电导率12ms/cm是未经调节的亲和层析洗脱中和。

3. CHO细胞体系中,不同上样pH和电导率条件下,HCPureTM均可有效去除HCP

 

3的检测结果可知,广泛的上样pH和电导率范围内,HCPureTM均可有效的去除上样料液中的HCP平均84%),同时保持目标分子的高回收率(平均87%)。此外,由于pH 6.0、电导率12mS/cm是初始的亲和层析洗脱中和液,因此,亲和层析后,料液可不经过调整或缓冲液置换,直接上样到HCPureTM中,同样保持优秀的回收率和HCP去除效果,且大大节约了工艺时间和成本。

 

3. HCPureTM在CHO细胞表达体系中可以有效去除聚集体

在该应用案例中,研究人员使用CHO细胞表达IgG型单克隆抗体,料液经过Protein A亲和层析和阳离子交换层析纯化后,在较低的pH和较高的电导率条件下孵育,诱导产生高含量的聚集体,再以流穿模式上样HCPureTM,收集流穿液和淋洗液,检测聚集体含量。

4. HCPureTM可显著去除抗体料液中的聚集体

 

由检测结果(表4)可看出,料液经过HCPureTM纯化后,聚集体由初始的6.7%低到2.9%,HCPureTM可显著去除料液中的聚集体。

 

4. HCPureTM在HEK 293细胞表达体系中可以有效去除HCP

在该应用案例中,研究人员使用HEK293细胞以瞬转的方式表达2型腺相关病毒(AAV-2),病毒载体经过亲和层析纯化,仍含有较高含量的低分子蛋白杂质,将亲和层析洗脱液置换到PBS+200mM NaCl(pH 7.5),以流穿模式上样到HCPureTM10mm内径层析柱,柱高10cm),总上样量为5.0E+13VP,收集流穿液和淋洗液进行分析。

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3. SDS-PAGE检测结果

 

5. ELISA检测结果

 

由SDS-PAGE结果(图3)看出,流穿液中包含大部分病毒衣壳蛋白VP1,VP2和VP3条带(8-13泳道,而再生液(14泳道中则包含大量的低分子蛋白杂质条带,表明HCPureTM可以有效去除料液中的蛋白杂质分子。由ELISA检测结果(表5可知,流穿液中的病毒衣壳蛋白几乎全部回收(接近100%),表明HCPureTM在去除蛋白杂质的同时可以保持优秀的AAV回收率。

 

HCPureTM多模式层析填料技术参数

 

HCPureTM多模式层析填料产品信息

散装填料

 

预装柱

 

如您对上述产品感兴趣,欢迎点击这里填写信息,Astrea Bioseparations技术专家将为您提供个性化优化方案,切实帮您解决纯化工艺中的疑难问题。

 

Astrea Bioseparations1987年孵化自剑桥大学,拥有超过30年层析介质研发和生产经验,是世界级层析介质产品与服务供应商。目前使用Astrea的产品已有超过21个生产工艺通过了FDAEMA的批准。Astrea Bioseparations在全球拥有3个研发和生产基地,专注为生物大分子和CGT领域提供行业领先的层析介质和技术服务。Astrea Bioseparations推出的基于纳米纤维的新型层析技术,解决了传统生物分离工具载量低和工艺耗时问题,实现更快、更环保、更具成本效益的纯化过程,完全符合当今生物治疗创新的需求。

 

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参考文献:

  1. J. Kreusser et al., Influence of pH value and salts on the adsorption of lysozyme in mixed-mode chromatography, 2021
  2. R. Hess et al., Standardized method for mechanistic modeling of multimodal anion exchange chromatography in flow through operation, 2023
  3. Technical Note: HCPURE?: A FIT FOR PURPOSE HOST CELL PROTEIN CLEARANCE SOLUTION IN E. COLI WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
  4. Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
  5. Technical Note: HCPure? host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
  6. Technical Note: HCPURE?: HOST CELL IMPURITY REMOVAL IN CHO WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
  7. Technical User Guide: HCPureTM, Astrea Bioseparations


 

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